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貨號：  YJS2392                                               規(guī)格：100管/96樣

山梨醇脫氫酶（sorbitol dehydrogenase，SDH）試劑盒說明書

微量法

正式測定前務(wù)必取2-3個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定

測定意義：

SDH（EC 1.1.1.14）催化山梨醇脫氫生成果糖，是調(diào)控生物體內(nèi)山梨醇含量的關(guān)健酶之一。

測定原理：

SDH催化山梨醇脫氫生成果糖，同時還原NAD⁺生成NADH，測定340nm吸光度增加速率可以計算SDH活性。

需自備的儀器和用品：

紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

試劑組成和配制：

提取液：液體 100mL×1 瓶，4℃保存；

試劑一：液體 10mL×1 瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存；

粗酶液提?。?/span>

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，

加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

（1）在試劑二中加入7.6mL試劑一和11.4mL蒸餾水充分溶解，置于37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴5min；用不完的試劑4℃保存一周；

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL樣本和190μL試劑二，混勻，立即記錄340nm

處20s時的吸光值A(chǔ)1和2min20s后的吸光值A(chǔ)2，計算ΔA=A2-A1。

SDH 活性計算：

a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）SDH 活力的計算

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘生成1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

SDH（nmol/min/mL）= [ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T=1608×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 SDH 活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

SDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr)÷T

=1608×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

SDH（nmol/min/g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總)÷T

=1608×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

SDH（nmol/min/10⁴cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=3.216×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10 ^-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。

b.用96孔板測定的計算公式如下

1、血清（漿）SDH 活力的計算

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘生成1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

SDH（nmol/min /mL）= [ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷V 樣÷T=3216×ΔA

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 SDH 活力的計算:

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

SDH（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V 樣×Cpr)÷T

=3216×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

SDH（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W× V 樣÷V 樣總) ÷T

=3216×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘生成1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

SDH（nmol/min /10⁴cell）=[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T

=6.426×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，2×10 ^-4 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L/mol/cm；d：96 孔板光徑，0.5cm；V 樣：加入樣本體積，0.01 mL；V 樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500 萬。

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