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羊外周血造血干細(xì)胞分離液說明書
更新時間:2016-06-08 點擊量:1296

羊外周血造血干細(xì)胞分離液說明書LGS1083W

 

羊外周血造血干細(xì)胞分離液說明書
【產(chǎn)品規(guī)格】
200ml/Kit
【產(chǎn)品組成】
為方便廣大用戶使用,試劑內(nèi)容如下:

 

名稱

產(chǎn)品規(guī)格

編號

A

羊外周血造血干細(xì)胞分離液

 

200ml

B

樣本稀釋液(贈品)

2010C1119

200ml

C

清洗液(贈品)

2010X1118

200ml

D

說明書

 

1份


【實驗前準(zhǔn)備】
A.適用儀器
zui大離心力可達(dá) 1200g的水平轉(zhuǎn)子離心機(jī)
B.耗材

產(chǎn)品名稱

產(chǎn)品貨號

產(chǎn)地

15ml離心管散裝

339650

美國  NUNC

15ml離心管架裝

339651

美國  NUNC

50ml離心管散裝

339652

美國  NUNC

50ml離心管架裝

339653

美國  NUNC

無菌膠頭滴管或塑料滴管

 

 


【檢驗方法】
全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在 20±2的條件下進(jìn)行。
首先取抗凝血按體積比 1:1的比例加樣本稀釋液(產(chǎn)品編號:2010C1119)混勻,
根據(jù)稀釋后的樣本量大小,分以下兩種情況:
情況 A:稀釋后的血液樣本量小于5ml 時,實驗方法如下:
1.取一支15ml離心管,先加入與稀釋后樣本等量的分離液(注:分離液zui少不得少于  3ml)。
2.用吸管小心吸取稀釋后的血液樣本加于分離液液面上,400-500g,離心20-30min(注:
根據(jù)血液樣本量確定離心條件,血液樣本量越多,離心力越大,離心時間越長,具體離
心條件需客戶自行摸索,以達(dá)到分離效果)。
 3.離心后,此時離心管中由上至下分為四層。*層為血漿層。第二層為環(huán)狀乳白色目的

細(xì)胞層。第三層為透明分離液層。第四層為紅細(xì)胞層。
4.用吸管小心吸取第二層環(huán)狀乳白色目的細(xì)胞層到另一 15ml離心管中,往所得離心管中
加入 10ml清洗液(產(chǎn)品編號:2010X1118),混勻細(xì)胞。
5. 250g,離心 10min。
6.棄上清。
7.用吸管以5ml清洗液(產(chǎn)品編號:2010X1118)重懸所得細(xì)胞。
8. 250g,離心 10min。
9.重復(fù)  6、7、8,棄上清后以 0.5ml后續(xù)實驗所需相應(yīng)液體重懸細(xì)胞。
10.差異貼壁法純化細(xì)胞
(1)用干細(xì)胞無血清培養(yǎng)基或干細(xì)胞*培養(yǎng)基以 1.5-3×10 6個/ml的密度重懸細(xì)胞,將細(xì)胞鋪于一次性細(xì)胞板或細(xì)胞瓶中,放于 37二氧化碳培養(yǎng)箱中進(jìn)行貼壁培養(yǎng)。
(2)2-4小時內(nèi)貼壁的為巨噬細(xì)胞前體(俗稱為單核細(xì)胞)。
(3)10-24小時內(nèi)貼壁的單個核細(xì)胞為內(nèi)皮、內(nèi)皮祖細(xì)胞、干細(xì)胞。
(4)不貼壁的為淋巴細(xì)胞。
注:
a)
無血清培養(yǎng)基中不含任何動物成分,為得到更佳培養(yǎng)效果可添加10%自體血漿或
2-8% 經(jīng)篩選的胎牛血清。
b)
c)
*培養(yǎng)基中含 2-20% 胎牛血清(血清具體含量由所培養(yǎng)的目的細(xì)胞而定)。
由于每種細(xì)胞的貼壁時間存在差異可將所得細(xì)胞分開已達(dá)簡單的純化目的,此法成
本相對較低。如需獲得高純度目的細(xì)胞則需在使用分離液后選用免疫磁珠陽性或陰
性分選。
情況 B:稀釋后的血液樣本量大于等于 5ml時,實驗方法如下:
1.取一支適當(dāng)?shù)碾x心管,先加入與稀釋后樣本等量的分離液。
2.將經(jīng)稀釋后的血液樣本小心加于分離液之液面上,450-650g(zui大離心力可至 1000g),
離心 20-30min。(注:根據(jù)血液樣本量確定離心條件,血液量越多,離心力越大,離心
時間越長,具體離心條件需客戶自行摸索,以達(dá)到分離效果。加入血液樣本后,樣
本及分離液總體積不得超過離心管總體積的三分之二)。
3.剩余步驟同“情況  A”中步驟 3至步驟  10。
  【注意事項】

1.全過程樣本、試劑及實驗環(huán)境均需在   20±2的條件下進(jìn)行。為獲得的實驗結(jié)果,
在取血 2h內(nèi)進(jìn)行實驗,血液存放時間越長,細(xì)胞分離效果越差。血液放置超過   6h
后分離效果更差甚至不能達(dá)到分離目的。
2.本實驗不使用高聚合材質(zhì)(如聚苯乙烯)的塑料制品,應(yīng)使用無靜電、低靜電離心
管及未經(jīng)堿處理過后的玻璃制品,因為靜電作用將導(dǎo)致細(xì)胞貼壁、堿處理的玻璃表面會
變成毛面,影響細(xì)胞分離效果。
3.吸取過多的目的細(xì)胞層及分離液層會導(dǎo)致分離液交界處的粒細(xì)胞被吸出從而使混雜的粒
細(xì)胞數(shù)量增加。
4.吸取過多的目的細(xì)胞層上層溶液會導(dǎo)致血漿蛋白及血小板混雜。
5.分離液用量大于稀釋后的血液樣本時,分離效果更佳。
6.如實驗后干細(xì)胞得率或活性過低,請以尋求幫助。
【儲存條件及有效期】
18-25保存,有效期 2年。本品易感染細(xì)菌,需無菌條件操作。無菌條件下操作,啟
封后置常溫保存。如 4保存,本分離液易出現(xiàn)白色結(jié)晶,影響分離效果。
【參考值(參考范圍)】
本實驗外周血干細(xì)胞提取率大于 80%。
下表為成年人外周血中各種細(xì)胞的數(shù)量及比例,用戶可適當(dāng)進(jìn)行參考。

【相關(guān)實驗技術(shù)方案】
1.所獲得干細(xì)胞的培養(yǎng)技術(shù)。
2.所獲得干細(xì)胞的核酸提取技術(shù)。
3.所獲得干細(xì)胞的鑒定方法
A.流式細(xì)胞技術(shù)
B.免疫組化技術(shù)
C.原位雜交技術(shù)
D.PCR技術(shù)

注:上述技術(shù)方案詳情請登陸本搜索“細(xì)胞分離、
純化、擴(kuò)增、鑒定及生物治療技術(shù)手冊”,并在說明書項目欄下下載使用。
【可能存在的問題及解決方法】
1.由于血液粘度、細(xì)胞密度等差異可能造成的問題及解決方案如下表所示:

出現(xiàn)情況

出現(xiàn)原因

建議解決方案

離心后目的細(xì)胞存在于血漿層或稀釋液層

轉(zhuǎn)速過小或離心時間過短

適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速

離心后目的細(xì)胞存在于分離液中

轉(zhuǎn)速過大或離心時間過長

適當(dāng)增減轉(zhuǎn)速

離心后白環(huán)層彌散

細(xì)胞密度過大

調(diào)整細(xì)胞密度

離心后白環(huán)層太淺或看不見

細(xì)胞密度過小

調(diào)整細(xì)胞密度
 

2.本分離液分離細(xì)胞的原理為密度梯度離心,其密度與溫度、大氣壓等密切相關(guān)。不同地
區(qū)客戶可根據(jù)當(dāng)?shù)厍闆r對離心條件進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。建議對離心條件進(jìn)行調(diào)整時,恒定離
心時間,對離心轉(zhuǎn)速進(jìn)行調(diào)整。
3.本分離液依照標(biāo)準(zhǔn),全部使用藥用級原料,性能指標(biāo)與國產(chǎn)同類產(chǎn)品略有不同,可
能出現(xiàn)紅細(xì)胞沉降不*的情況,可以適當(dāng)加大離心轉(zhuǎn)速。
注:在對離心條件進(jìn)行調(diào)整時,離心轉(zhuǎn)速的加減以 50-100g為基數(shù),直至達(dá)到分離效果,
離心力zui小不得小于 400g,zui大不得大于 1200g。離心時間以 20-30min為準(zhǔn)。

滬公網(wǎng)安備 31011802001677號

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